Diese Gruppe besteht aus Amikacin, Gentamicin, Kanamycin, Neomycin (Auge, Haut, teilweise + Dexamethason), Paromomycin, Streptomycin und Tobramycin. Aminoglykoside sind wie Glykopeptide im Magen-Darm-Trakt nicht resorbierbar. Sie werden daher parenteral oder lokal am Auge sowie auf Haut und Schleimhäuten angewendet. Wichtigste Nebenwirkungen sind die Schädigung von Gehör- und Gleichgewichtsorgan (kann auch noch nach Therapieende auftreten) sowie Nierenschäden.

Paromomycin wird oral zur Dekontamination des Darms verwendet. Es tötet Bakterien ab, die im Darm aus Eiweißen der Nahrung Ammoniak bilden. Bei Leberzirrhose kann Ammoniak nicht entgiftet werden und reichert sich daher im Blut an. Ammoniak beeinträchtigt die Hirnfunktion stark (hepatische Enzephalopathie). Paromomycin ist außerdem gegen Amöbenbefall des Darms wirksam.

Das chemisch eng mit Paromomycin verwandte Neomycin wird ebenfalls nur lokal angewendet: auf der Haut, auf Schleimhäuten sowie am Auge.

Kanamycin wird nur gegen Infektionen am Auge verwendet.

Gentamicin weist strukturelle Ähnlichkeiten mit Kanamycin auf. Es wird parenteral bei schwersten lebensbedrohlichen Infektionen sowie örtlich auf der Haut und am Auge verwendet. Als implantierbare Kette setzt man Gentamicin auch zur Behandlung von Knocheninfektionen ein.

Amikacin ist chemisch mit Kanamycin verwandt. Es wird parenteral bei schwersten Infektionen eingesetzt, die auf Gentamicin nicht ansprechen.

Tobramycin wird wie Amikacin parenteral gegen systemische Infektion angewendet, die auf Gentamicin nicht reagieren. Eine weitere Indikation ist die Bekämpfung einer chronischen Besiedlung der Lungen durch Pseudomonas bei CF. Hier erfolgt die Anwendung inhalativ über einen Vernebler.